اطلاعاتی راجع به بعضی از کشت های میکروا ورگانیسم ها

میکروسکوپ الکترونی (electron microscope)

قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی از میکروسکوپ نوری بهتر است به این معنی که با میکروسکوپ الکترونی اجزای کوچکتری را می توان دید. قبلا گفته شد حد تفکیک (R) به طول موج نوری بستگی دارد که به نمونه می تابد. در حقیقت بین این دو رابطه مستقیمی وجود دارد یعنی هر چقدر طول موج تابشی کوچکتر باشد ،R نیز کوچکتر و قدرت جداسازی بیشتر است. در میکروسکوپ الکترونی بجای استفاده از نور مرئی از امواج الکترون ها استفاده می شود. در شرایط مناسب طول موج الکترون ها به nm ۰/۰۰۵ می رسد. در این طول موج بهترین R ممکن حدود nm ۰/۰۰۲ است. در عمل به علت محدودیت های دیگر ، قدرت جداسازی میکروسکوپ های الکترونی هیچ وقت به این خوبی نیست.حد تفکیک با میکروسکوپ الکترونی برای ملکول های تخلیص شده ی زیستی ، حدودنانومتر  ۰/۱ و برای سلول ها نانومتر۲ است که دست کم 100 برابر بهتر از بهترین میکروسکوپ های نوری است.

دو نوع میکروسکوپ الکترونی به نام میکروسکوپ الکترونی گذاره و میکروسکوپ الکترونی نگاره وجود دارد.

 

 

باسیلوس استئاروترموفیلوس1 باکتری اسپوردار هوازی است که نسبت به حرارت و مواد شیمیائی بسیار مقاوم است . دمای مناسب برای رشد آنها 55 تا 60 درجه سلسیوس و برای تعدادی از آنها 35 و بالای 75 درجه سلسیوس و PH مناسب برای رشد آنها 7 می‏باشد . این باکتری‏ها در غذاهای کنسروی با تخمیر کربوهیدرات‏ها تولید اسید بدون گاز می‏کنند یعنی بدون اینکه در قوطی کنسرو بادکردگی ایجاد نمایند آن را فاسد می‏کنند و به همین دلیل به آنها باکتری‏های عامل " فساد صاف "2 می‏گویندMilk / Bacillus strearothermophilus

یک باکتری برای بررسی مواد ضدعفونی یا اگر خولستار امتحان کردن محیط اتو کلاو استفاده می شود اگر اتو کلاو خوب باشد به راحتی از بین خواهد برد

 

 

 

Bacillus megaterium

 

باسیلوس مگاتریوم یک باکتری استوانه ای شکل تاحدودی متمایل به تخم مرغ یا گلابی شکل با قطری در حدود ۵/١-٢/١ میکرومتر است که فرمهای کوتاه زنجیره های پیچ و تاب خورده را ایجاد می کند. اسپور در مرکز و در وسط باکتری است و اندازه آن از کوتاه تا کشیده تخم مرغی شکل است. اسپور در خاک یافت می شود

 

Bacillus thuringiensis

در این شیوه پروتئینی به نام cry 1 Ab  را از باکتری به نام باسیلوس تورینجینسیس که سابقه 100 سال استفاده در آفت کشی داردجدا میکنند و تحت پیش بری به برنج منتقل می کنند در نهایت این ژن در بافت های سبز نظیر برگ ساقه و غلاف تظاهر پیدا میکند و آفاتی را که دربافت سبز وجود دارند از بین می برد

 

میکروسکوپ الکترونی گذاره (transmission electron microscope) زودتر اختراع شد و قدرت جداسازی بهتری دارد. در این نوع میکروسکوپ ، الکترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می کنند و از منطقی دیگر بازتابیده می شوند. عامل تعیین کننده در این امر در نهایت ویژگی اتم های تشکیل دهنده ی مناطق مختلف سلول است. الکترون های عبوری در دستگاه تشخیص داده می شوند و تصویری از نمونه حاصل می شود. سلول های زنده با میکروسکوپ الکترونی قابل مشاهده نیست

در میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) مانند میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، یک پرتو الکترونی به نمونه می‌تابد.

 

1- مطالعه ساختار میکروسکوپی مواد و شناسایی فازهای مختلف تشکیل دهنده ماده.

2- مطالعه بلورشناسی و ساختمان کریستالی مواد با استفاده از طرح پراش الکترون.

3- اندازه گیری ابعاد و قطر ذرات و مرز دانه ها در مقیاس انگستروم.

4- امکان حرارت دهی نمونه تا 1000 درجه سانتیگراد جهت مطالعه تغییر ساختار بلوری و تبدیلات فازها در حین تصویر برداری از نمونه.

5- مشاهده مستقیم ساختار داخلی مواد تا بزرگ نمایی 620000 برابر و قدرت تفکیک خطی 2/5 انگستروم.

6- امکان عکسبرداری از قسمت های مختلف نمونه.

7-امکان مطالعات بافت های نرم در نمونه های بیولوژیک.

 

BACILLUS POLYMYXA  گونه ای از باکتری های هوازی که شرایط ومحیط مساعد برای زیست آن بین 30 تا 35 درجه سانتگیراد است

 

تعریف کشت :

هنگامیکه باکتریها در شرایطی مناسب قرار گیرند که قادر به تکثیر و رشد باشند اصطلاحا گفته می شود باکتری کشت داده شده است .

تعریف محیط کشت :

از آنجا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آنکه نیاز به سلول دیگری داشته باشد . این اصل بیانگر آن است که میکروبها هم احتیاج به غذا و آب و موادآلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.

این محیط کشت می تواند بصورت دست ساز بوده یا یطور طبیعی یعنی داخل سلولهای بدن یک جانور باشد.

خون بهترین محیط برای رشد یک باکتری می باشد جون تمام احتیاجات یک باکتری اعم از اکسیژن ، مواد مغذی ، PH  مناسب ، درجه حرارت لازم و غیره را برای یک باکتری فرآهم می کند.

میکروبها را می توان بر روی محیطها و در ظروف مختلف کشت داد که انتخاب شکل بستگی به نوع کشت داد. مثلا در کشتهایی که محیط آن مایع است ظروف کشت لوله ای می باشد و محیطهای جامد(آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می شوند.

بیشتر محیطهای کشت که درپلیت مصرف می شوند ، محیطهای کشت عمومی هستند که اساسا برای تهیه مواد غذایی لازم جهت رشد باکتری ساخته شده اند . بعضی مواقع این محیطهای کشت عمومی را با اضافه کردن اجزای مغذی که موجب افزایش سریع رشد ارگانیسمها ی سخت رشد می شوند ، غنی می کنند. ماهیت این مواد مغذی چنان است که نمی توان آنها را همراه با محیط اصلی سترون کرد ، بلکه باید بعد از اتوکلاو شدن محیط بطور سترن این مواد اضافه شوند. نمونه هایی از این مواد مغذی عبارتند از : شیر بی چربی ، خون گوسفند ، زرده تخم مرغ و ....

انواع محیط کشت

محیطهای کشت انتخابی :

بعضی از مواد مغذی دارای یک عامل انتخابی هستند که ویزه جداسازی یا کشت گروه خاصی از میکروبهاست . عامل انتخابی معمولا با جلوگیری از رشد ارگانیسمهای نامطلوب عمل می کند و از این راه موجب رشد شدیدتر ارگانیسمهای مطلوب می شوند. وقتی عامل انتخابی به محیط کشت اضافه می شود در این صورت محیط کشت را انتخابی می گویند.بعنوان مثال ، سدیم کلرید آگار برای استافیلوکوکها انتخابی است.

محیطهای افتراقی :

محیطهای کشت افتراقی اجزایی دارند که موجب می شوند برخی از ارگالنیسمها در مقایسه با باکتریهای دیگری که درهمان محیط کشت رشد می کنند به شکل متفاوتی ظاهر شوند . مثلا بعضی از باکتریها خاصیت همولیز دارند بدین معنا که تولید آنزیم همولیزین می کنند که این آنزیم در محیط آگار خون دار باعث پاره شده (لیز شدن) گلبولهای قرمز شده و کلنی آن در محیط کشت برنگ روشن دیده می شود . این هملیز ممکن است ناقص و یا کامل باشد.

مجموعه ای از باکتریها که در روی محیط کشت کنار هم رشد می کنند بر اثر رشد و تکثیر ، تشکیل نقاط برجسته ای روی محیط کشت می دهند که اندازه آنها متفاوت بوده و بستگی محیط کشت و میزان رشد و تکثیر باکتری و .... دارد . این مجموعه نقاط را کلنی (پرگنه ) می نامند.

سایر محیطهای افتراقی اغلب دارای یک معرف PH هستند . مثلا محیط آگار آهن دار 3 قندی (TSI) از این نوع می باشد . محیطهای کشت افتراقی بویزه زمانی مفیدند که با میکروبهایی با شکل و مشخصات یکسان مواجه هستیم .

اغلب محیطهای کشت هر دو ویزگی را با هم دارند مانند مکانکی آگار(MC) این محیط دارای نمکهای صفراوی و مقدار بسیار کمی کریستال ویوله است که هر دو از رشد باکتریهای گرم مثبت جلوگیری می کنند همچنین دارای لاکتوز و معرف PH  قرمز خنثی است که کلونی های تخمیرکننده لاکتوز را به رنگ قرمز در می آورد وممکن است در محیط اطراف کلنی ها حلقه قرمز رنگ تشکیل دهند . کلنی باکتریهایی که قادر به تخمیر لاکتوز نیستند بی رنگ دیده می شوند.

 

محیطهای غنی کننده :

این محیطها معمولا در مواردی بکار می روند که تعداد میکروبهای مورد جستجو در نمونه غذایی کم بوده و یا بعلت وجود زیاد میکروبهای دیگر جدا کردن آن با اشکال مواجه است . این محیطها امکان رشد برای میکروبها را از نظر PH و مواد غذایی فراهم می سازد.

 

محیط کشت کامل :

این محیط کلیه مواد لازم برای رشد باکتریها را دارد و فاقد مواد ضد میکروبی است و حدود 80% از باکتریها می توانند در آن رشد کنند . این محیطها فاقد هر گونه مهارکننده و اندیکاتور بوده ، لذا با رشد میکروبهای مختلف بر روی آن هیچگونه تغییر رنگی مشاهده نمی شود. در این میان محیط P.C.A(پلیت کانت آگار) در مقایسه با N.A(نوترینت آگار) از کیفیت مغذی بالاتری برخوردار بوده و برای رشد میکروبها مناسب تر می باشد.

محیطهای کشت جامد بعلت دارا بودن آگار در ترکیب خود بصورت جامد می باشند.

آگار چیست ؟

یک نوع آلگ دریایی می باشد که بر خلاف زلاتین می تواند حرارت 37 درجه را که برای رشد تمام باکتریهای بیماریزای انسان مناسب است را تحمل نماید و هیچ میکروبی نمی تواند آنرا ذوب و هضم نماید. آگار ساختمان پلی ساکاریدی دارد که بوسیله یکسری از جلبکهای دریایی ساخته می شود. نقطه ذوب آن 95 درجه و نقطه انجماد آن حدود 43 درجه سانتیگراد است .

انواع کشت باکتری :

1-        کشت باکتری در محیط کشت مایع (براث)

2-        کشت باکتری در محیط کشت جامد(آگار)

روش کشت باکتری در محیط کشت مایع :

1-        ابتدا یک آنس برداشته و آنرا در دست راست بگیرید . بعد آنرا روی شعله کاملا سترون کنید و بگذارید تا سرد شود.

2-        محیط حاوی باکتری (لوله یا پلیت) را در سدت چپ بگیرید و درب آنرا با دست راست در کنار شعله باز کنید . دقت کنید که درب محیط کشت را روی میز کار خود نگذارید.

3-        اگر محیط کشت در لوله است دهانه آنرا چند با ر از روی شعله عبور دهید تا سترون شود همچنین درب لوله را بیش از حد باز نگه ندارید.

4-        نوک آنس را وارد محیط کرده و یک لوپ از آنرا بردارید. منظور از لوپ سوزن کشت با نوک حلقه ای است .

5-        دهانه لوله را مجددا با شعله سترون کرده و درب آنرا بگذارید و محیط کشت را در جای خود قرار دهید.

6-        لوله حاوی محیط کشت را در دست چپ بگیرید و نوک آنس آلوده  به باکتری مورد نظر را داخل محیط فرو برده و به آرامی تکان دهید تا میکروبها در محیط پخش شوند.

7-        در مواردی که میکروب را از پلیت (محیط کشت جامد) برمی دارید با نوک آنس کمی از پرگنه را برداشته و با رعایت موارید که گفته شد آنرا داخل محیط مایع فرو برده و به آرامی هم بزنید تا همگن شود.

8-        دهانه لوله حاوی محیط کشت جدید را با شعله سترون کرده و درب آنرا بگذارید و آنرا در داخل انکوباتور قرار دهید.

9-        نوک آنس را مجددا با شعله استریل کرده و در جای خود قرار دهید.

روش کشت باکتری در محیط جامد:

محیط کشت جامد به دو صورت وجود دارد : 1- محیط کشت جامد در لوله 2- محیط کشت جامد در پلیت

در لوله به دوصورت عمودی(Stab Culture)و شیبدار(Slant Culture )دیده می شود که هر کدام از آنها روش کشت خاص خود را دارند.

روش کشت عمقی در لوله :

در اینحالت محیط کشت آگاردار (جامد) را با حفظ شرایط استریل در حالت مذاب داخل لوله های آزمایش استریل ریخته و بحالت عمودی آنرا در یک جای ساکن قرار دهید تا سرد سود در اینحالت با آنس نوک تیز استریل شده در کنار شعله از پرگنه باکتری مقداری را برداشته و آنرا بصورت عمودی در مرکز این محیط تا انتها فرو برده و بدون هیچگونه تغییر حالتی آنرا از همان مسیر خارج کنید . بعد لوله را در انکوباتور قرار دهید .

این روش کشت دارای خصوصیاتی می باشد و آن اینست که هنگامی که نوک آنس را در محیط فرو می برید در ابتدای ورود آنس به محیط تراکم باکتری زیاد است و به ترتیب که به عمق محیط فرو می رود از تعداد باکتریها کاسته می شود تا به انتهای لوله که می رسد تراکم باکتری با حداقل می رسد و از طرفی در انتها محیط کشت لوله ای اکسیژن کمتر از قسمت سطحی آن است و باکتریها به ترتیبی با تراکمی که وارد محیط شده اند براساس نیاز با اکسیژن (هوازی یا بیهوازی بودن )در محیط رشد متفاوتی دارند یعنی اگر باکتری هوازی باشد رشد آن در قسمت سطحی بیشتر است و اگر بیهوازی باشد رشد آن در قسمت عمقی بیشتر می شود.

روش کشت در سطح شیبدار در لوله :

در اینحالت محیط کشت آگاردار استریل را در لوله های استریل شده  ریخته و قبل از سرد شدن آنها را بحالت شیبدار قرار می دهند تا سرد شوند. در اینحالت با آنس نوک تیز با حفظ شرایط استریل از پرگنه باکتری برداشته و در کنار شعله نوک آنس را ابتدا بصورت عمودی وارد قسمت عمودی محیط کشت کرده بعد به آرامی آنرا از همان مسیر خارج کرده و بدون اینکه نوک آنس از محیط جدا شود آنرا به حالت زیگزاک روی سطح شیبدار بکشید.

این روش هم خصوصیات بسیار زیادی از جهت تشخیص سویه های باکتری دارد و اطلاعاتی در مورد هوازی  یا بی هوازی بودن آنها و همچنین خصوصیات منحصر به فرد باکتریها به ما می دهد . مثلا ممکن است درکشت یک نوع باکتری ، رنگ قسمت عمودی محیط کشت تغییرکند که نشانگر بی هوازی یا بیهوازی اختیاری بودن باکتری است که بعدا در تستهای اختصاصی دیگر را روی آن انجام می دهیم.یا مثلا باکتریها فقط در قسمت شیبدار رشد می کنند و رنگ آن قسمت تغییر می کند که پی به هوازی بودن آن می برید.

روش دیگر کشت روی این محیط از محیط مایع می باشد که یک لوپ از کشت مایع باکتریایی برداشته و در سطح شیبدار بصورت زیگراک می کشید و کشت می دهید.

روش تهیه محیطهای کشت :

مطابق دستور کارخانه سازنده  و با توجه به بروشور الصاقی روی آن می توان مقدار لازم از محیط کشت که بصورت پودری یا پلیت شده می باشد را برداشته و با مقدار توصیه شده  آب مقطردر داخل ارلن مخلوط کنید بعد آنرا با توجه به دستور کارخانه  اگر لازم بود روی شعله قرار داده تا بر اثر حرارت شفاف شود که البته در بعضی از محیطها نیازی به این کار نیست . بعد آن را در اتوکلاو قرار داده و بمدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد قرار می دهید تا استریل شود . بعضی از محیطهای کشت که به دمای بالا حساس می باشند در اتوکلاو قرار نمی گیرند و این مسئله را کارخانه سازنده حتما متذکر شده است  . بعد از اتوکلاو گذاری محیطهای کشت آگار دارداخل ارلن سفت می شود و برای استفاده از آنها باید دوباره حرارت داده شوند ولی محیطهای کشت مایع به شکل مایع باقی می مانند و آماده مصرف هستند.

روش تهیه محیط پیش ریخته :

بعد از تهیه محیط کشت که قبلا توضیح داده شد برای تهیه محیط پیش ریخته باید از محیطهای آگار دار(جامد) استفاده نمود به ترتیب که ابتدا ارلن حاوی محیط کشت را روی شعله قرار دهید تا کاملا مذاب شود بعد تازمانی که دمای آن به حدود 45 درجه سانتیگراد برسد صبر می کنید چون اگر دمای آن بالاتر باشد بخار زیادی روی درب پلیت جمع می شود . بعد از رسیدن به دمای مطلوب در کنار شعله و با حفظ موازین استریل از محیط کشت بمقدار 15 تا 20 سی سی در پلیتهای استریل می ریزید و بعد درب آنرا گذاشته و در یک جای ساکن می گذارید تا سرد شوند در اینحالت محیط پیش ریخته آماده می باشد.

کشت در پلیت : به سه روش قابل انجام است .

1-        کشت خطی

2-        کشت سطحی

3-        کشت آمیخته یا پورپلیت

روش کشت خطی :

در این روش از محیط پیش ریخته استفاده می شود. به این ترتیب که ابتدا بوسیله یک آنس سترون شده مقداری از پرگنه باکتری را برداشته و آنرا روی سطح محیط پیش ریخته بصورت خطهای موازی و در چند جهت می کشیم . در کشتهای خطی برای بدست آوردن کلنی های تک می توانیم پلیت را به 4 قسمت تقسیم کنید بعد در قسمت اول ابتدا نوک لوپ را که محتوی پرگنه باکتری است را بصورت خطهای موازی کشیده و بعد خطوط را در منطقه دوم از انتهای خط انتهایی منطقه اول در جهت دیگر ادامه می دهیم و در منطقه سوم و چهارم هم به همین صورت عمل می کنیم . خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط موازی را روی سطح محیط می کشیم به ترتیب از تراکم باکتریها کاسته می شود و به انتهای خط که می رسیم تراکم باکتری کمتر است و در منطقه دیگر وقتی از انتهای خط منطقه قبلی استفاده می کنیم در واقع تراکم بسیار کمتر از تراکم باکتریها در ابتدا می باشد و در نتیجه در مناطق دیگر هم به ترتیب از تعداد باکتریها کاسته می شود تا جائیکه در منطقه چهارم شما می توانید پرگنه های تکی داشته باشیم که کلنی خالص نامیده می شود. بنابراین انجام درست کشت خطی منجر به ایجاد کلنی خالص می شود این کلونی تنها از یک باکتری مادری بوجود می آید (تعریف کلنی خالص). باکتریهای  منفرد را باکتریهای مادر می نامند که این باکتریها پس از کشت خطی و جدا شدن سلولهای باکتری از یکدیگر بوجود می آیند.

باید توجه داشته باشیم که کلنی خالص به کلنی گفته می شود که با کلنی دیگر تماس نداشته باشد.

در مورد محیطهای کشت باکتریایی که بصورت مایع می باشند برای انجام کشت خطی روی محیط پیش ریخته فقط یکبار لوپ را داخل محیط محتوی باکتری کرده و یک لوپ از آن برداریم سپس آنرا روی محیط پیش ریخته قرار داده و بصورت خطوط موازی آنرا در چند جهت بکشیم.و یا مراحل فوق را روی آن انجام دهیم.

 

 

کشت سطحی :

در این نوع کشت هم از محیط پیش ریخته استفاده می شود.

نحوه کشت :

این روش کشت بیشتر برای محیطهای مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیسمهای موجود در آن را مشخص نمود.

برای اینکار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه می کنیم. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانیم کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنیم باید توجه داشته باشیم که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .

چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یک گرمخانه با دمای 50-25 درجه قرار داده و خشک نمود.به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهیم تا قطرات رطوبت حذف گردد.

همچنین می توانیم پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائیم. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

کشت آمیخته  یا پورپلیت :

در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد . یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان 1 سی سی از آنرا در کف پلیت استریل ریخته سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود 45 درجه سانتیگراد رسیده بمیزان 15-20 سی سی به پلیت اضافه نمائی. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد 8 انگلیسی آنرا کاملا مخلوط کنیم. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیط کشت بپوشانیم دراینحالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

نکته!

مواد لازم و روش تهیه رنگ برای رنگ آمیزی منفی:
مرکب هندی یا چین,مرکب رسم پلیکان شماره 17 جهت آزمایش پیشنهاد می شود.به عنوان محافظ 3/0% تری کروزول به آن می افزاییم.
روش رنگ آمیزی :
در روش رنگ آمیزی با مرکب هندی,کپسول ذرات کلوئیدی کربن مرکب را جذب کرده و در نتیجه به صورت یک هاله شفاف اطراف میکروارگانیسم مشاهده می شود .این روش برای مشاهده کپسول پنومونیه توصیه می شود.
1- یک قطره رنگ نیگروزین یا مرکب هندی را در یکی از دو انتهای لام قرار دهید.
2- یک لوپ پر از باکتری های مورد نظر را در قطره رنگ وارد میکنیم و با فیلدوپلاتین رنگ و باکتری ها را با هم مخلوط کنید.
3- یک لام دیگر برداشته و روی قطره رنگ حاوی باکتری ها قرار داده و بوسیله آن گسترش را آماده کنید.
خشک کردن گسترش و میکروسکوپی آن.
تفسیر رنگ آمیزی :
در این رنگ آمیزی باکتری ها بیرنگ , شفاف و در زمینه ای سیاه رنگ مشاهده می شود

 

مشاهده ساختمان های مختلف باکتری :
1)رنگ آمیزی کپسول:
کپسول یک لایه ژلاتینی خارجی است که از سلول ترشح شده و آن را احاطه کرده و به دیواره سلولی متصل است.تمامی میکروارگانیسم ها قادر به تولید کپسول نمی باشد .سلول هایی که کپسول ضخیم دارند عموما بیماریزا می باشند زیرا این ساختمان باکتری را در مقابل عمل فاگوسیتوز سلول های میزبان محافظت می کند.
مراحل رنگ آمیزی کپسول _ روش جینز (jins ) :
1-تهیه گسترش از باکتری کپسول دار مانند کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae )
2-خشک کردن گسترش در مجاورت هوا
3-اضافه کردن رنگ کریستال ویوله 2% به مدت 1 دقیقه
4-بسرعت آن را با جریان ملایم آب بشویید.
5-افزودن اسید استیک 1-2 % به مدت 10 ثانیه
6-شستشو لام با جریان ملایم آب
7- خشک کردن
8-مشاهده میکروسکوپی
در این روش جسم رویشی باکتری به رنگ آبی و کپسول به رنگ صورتی کمرنگ دیده می شود.

لازم به ذکر است که در رنگ آمیزی کپسول نیازی به مرحله فیکس کردن به وسیله حرارت نیست زیرا حرارت سبب کوچک شدن سلول و ایجاد هاله شفاف کاذب می شود که ممکن است با کپسول اشتباه شود.رنگ آمیزی اسپور :
اسپور حالت مقاوم سلول رویشی باکتری است . بعضی از باکتری ها در شرایط نامساعد محیط قابلیت تشکیل سلول مقاوم از سلول رویشی را دارند که در این حالت چون در درون سلول رویشی تشکیل می شود به آن اندوسپور گفته می شود هنگامیکه این فرم از سلول خارج می گردد به آن اسپور گفته می شود .
اسپور به دلیل داشتن پوششهای غیر قابل نفوذ در برابر شرایط نامساعد همچون کمبود رطوبت و دما و نور,
امواج رادیویی , مواد شیمیایی, انجماد, خشکی مقاوم می باشد.
اسپور زایی یک مرحله زایشی در چرخه سلول باکتری به حساب نمی آید بلکه یک مرحله استراحت (کمون ) بوده که در آن متابولیسم سلول غیر فعال شده و شرایط نامساعد را تحمل می کند.در صورت مساعد شدن شرایط اسپور قادر است به فرم رویشی تبدیل شود که این عمل طی سه مرحله انجام می شود عبارتند از:
فعال شدن ,جوانه زدن,تبدیل اسپور به فرم رویشی
مراحل رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین:
1-انجام مراحل 1 تا 3
4-افزودن رنگ مالاشیت گرین به مدت 10-15 دقیقه همراه با حرارت
سه نکته باید توجه شود:
ü رنگ خشک نشود.
ü رنگ نجوشد.
ü در صورت تبخیر مرتبا رنگ اضافه شود.
5-شستشو با آب
6-افزودن رنگ زمینه (سافرانین ) به مدت 1 – 2دقیقه
در این مرحله سلول های رویشی رنگ قرمز به خود می گیرند و به رنگ قرمز – صورتی دیده می شوند ولی اسپورها سبز دیده می شوند.
7- شستشو با آب
8- خشک کردن
9-مشاهده میکروسکوپی


محیط های کشت میکروبی

محیط کشت :

محیط کشت ، محیط مایع یا جامدی است که به منظور کمک به رشد میکروارگانیزم یا سلول ها طراحی می شود . این محیط ها حاوی منبع کربن ونیتروژن مشخص و عناصر ضروری و ویتامین های مورد نیاز میکروب می باشد .

 

محیط افتراقی Differential medium :

شامل برخی از انواع معرف ها و رنگ ها است که سبب تمایز یکسری از باکتری ها از سایرین می شود .

 

محیط حداقل Minimal medium  :

این محیط شامل امکانات غذایی حداقل برای رشد کلنی بوده و بطور معمول فاقد اسیدهای آمینه اند . این محیط های کشت به منظور رشد سوش های وحشی میکروارگانیزم ها مورد استفاده قرار می گیرد . رش باکتری در این محیط کند است .

 

محیط انتخابی Selective medium  :

این محیط ها برای رشد باکتری های مطلوب بهینه شده اند . در این محیط ها تنها باکتری های مورد نظر رشد می یابند . برای مثال اگر یک ارگانیزم به آنتی بیوتیک خاصی مثل آمپی سیلین یا تتراسیکلین مقاوم باشد میتوان این آنتی بیوتیک را به محیط کشت اضافه نمود ، در این صورت سایر سلول های حساس به این آنتی بیوتیک قادر به رشد نخواهند بود .

 

محیط غنی شده Enriched medium  :

این محیط شامل نیازهای غذایی پیچیده مورد نیاز برای رشد میکروارگانیزم می باشد .

 

 

Agar :

آگار یک پلی ساکاریدی است که از دو جزء ساخته شده است :

·         آگارز agarose

·         آگاروپکتین agaropectin

 

آگارز یک پلی ساکارید خطی است که از بتا دی گالاکتوز و 3و6 انهیدرو آلفا ال گالاکتوز تشکیل شده است.
Beta-D-galactose + 3-6anhydro-alpha-L-galactose =agarose

                 

آگاروپکتین یک پلیمر اسیدی است . واحدهای آگاروپکتین مانند آگارز است با این تفاوت که در برخی از جایگاهها گروههای سولفات ، متیل و پیرویک اسید جایگزین شده است .

آگار در دمای 30-40 درجه سانتیگراد به فرم ژل و در دمای 90-95 درجه به حالت سل درمی آید . آگارز در ایجاد حلت ژل در آگار نقش دارد .

آگار برای جامد کردن محیط های کشت استفاده می شود و با سایر ترکیبات موجود مانند عصاره گوشت ، پپتون ، پروتئین ها ، قند ، پیگمان ها ، معرف ها ، بازدارنده ها و ... واکنش نمی دهد . حتی پس از اتوکلاو نیز تغییر ساختار یا رنگ نمی دهد . علاوه بر اینها ارگانیزم ها قادر به استفاده از آگار به عنوان منبع انرژی نیستند .

 

Mannitol Salt Agar :

این محیط یک محیط کشت انتخابی – افتراقی است ، حاوی 5/7 % نمک ، قند مانیتول و معرف PH فنل رد می باشد . غلظت بالای نمک آن عامل انتخابی شدن محیط و عدم رشد بسیاری از باکتری ها می گردد .

اعضای استافیلوکوک قادر به رشد در این محیط اند . S.aureus علاوه بر رشد میتواند با تخمیر مانیتول تولید اسید کند که باعث کاهش PH می شود . در PH اسیدی فنل رد از قرمز به زرد تغییر رنگ می دهد .

استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس قادر به تولید اسید نیستند ، پس کلنی های قرمز تشکیل می دهند . این امر سبب افتراق اورئوس از ساپروفیتیکوس و اپیدرمیدیس می شود .

                         

                      

 

Eosin Methylene Blue Agar :

یک محیط انتخابی – افتراقی حاوی مواد زیر است :

·         پروتئین

·         بافر

·         متیلن بلو

·         ائوزین

·         کربوهیدرات های سوکروز و لاکتوز

 

رنگ های ائوزین و متیلن بلو مانع از رشد باکتری های گرم + شده و به باکتری های گرم – اجازه رشد می دهند . لاکتوز و سوکروز منبع کربن اند و باکتری ها بر اساس توانایی تخمیر و عدم تخمیر لاکتوز از هم جدا می شوند . (سوکرز منبع کربن برای باکتری هاییست که لاکتوز را تخمیر نمی کنند . )

لاکتوز + ها کلنی تیره و لاکتوز – ها کلنی شفاف تولید می کنند .

 

                         

 

 

Mac Conkey Agar :

این محیط ، یک محیط انتخابی – افتراقی است که سبب رشد انتروباکتریاسه و باکتری گرم – و افتراق لاکتوز + ها از لاکتوز – ها می شود . حاوی مواد زیر است :

·         پروتئین

·         نمک صفراوی

·         کلرید سدیم

·         لاکتوز

·         کریستال ویوله

·         قرمز خنثی

 

عمل انتخابی محیط مربوط است به کریستال ویوله و نمک صفراوی که مانع رشد گرم + ها می شوند. آنها که لاکتوز + اند به رنگ قرمز صورتی اند که ناشی از تولید اسید از تخمیر لاکتوز و جذب آن توسط نوترال رد و بدنبال آن تغییر رنگ معرف به قرمز می باشد. لاکتوز – ها کلنی بی رنگ ایجاد می کنند .

 

                       

 

Triple Sugar Iron Agar  ( TSI ) :

این محیط برای شناسایی باسیل گرم – بر اساس توانایی تخمیر لاکتوز ، گلوکز و سوکروز و تولید SH2 می باشد . محیط حاوی مواد زیر است :

·         1/0% گلوکز ، 1% لاکتوز ، 1% سوکروز

·         منبع سولفور

·         کلرید سدیم

·         پروتئین

·         معرف SH2

·         فنل رد

 

تخمیر قندها توسط میکروارگانیزم همراه با تغییر رنگ است .

باکتری تخمیر کننده گلوکز مقادیر فراوانی از اسید را تولید می کند و رنگ محیط را زرد رنگ می کند . مواد قلیایی نیز در اثر دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو پپتون تولید می شود . این مواد قلیایی مقدار کم اسید تولید شده در سطح را که در اثر تنفس ایجاد شده خنثی می کند ، اما نمی تواند مقدار فراوان اسید ته لوله را خنثی کند . بنابراین بالای لوله قرمز و ته آن زرد است . K/A) )

باکتری هایی که علاوه بر گلوکز می توانند لاکتوز و سوکروز را نیز تخمیر و تولید اسید کنند سبب زرد شدن کل لوله می شوند .( مقدار اسید تولیدی زیاد است ) A/A) )

عدم تغییر رنگ محیط نشاندهنده عدم تخمیر قندهاست که در این صورت احتمالا باکتری باسیل روده ای نیست .(K/K  )

تولید گاز همراه با ایجاد ترک و حباب در محیط است . SH2 در نتیجه احیای تیوسولفات سدیم است . این گاز با سولفات آمونیوم فریک محیط ترکیب شده و رسوب سیاهی را ایجاد می کند .

KIA (کلیگر ایرون آگار ) مشابه TSI است با این تفاوت که فاقد سوکروز می باشد .

 

|+| نوشته شده توسط سید ابوالفضل حسینی نسب در جمعه بیست و ششم فروردین 1390  |
 
 
بالا